l 传统疫苗学的发展
自Dames Phipps发明牛痘疫苗后，各类疫苗如炭疽、狂犬、猪瘟、流感疫苗等的相继出现，极大地改善了人和动物的健康状况，有效抑制了许多疾病的流行和传播。伴随着近几十年来微生物学、免疫学、分子生物学等的发展，疫苗研究也取得了长足的进步和突破。在最初弱毒疫苗和灭活疫苗的基础上，各类新型疫苗如重组亚单位疫苗、基因缺失疫苗、重组活载体疫苗及DNA疫苗也相继被研究和开发，代写医学论文并成功解决了疫苗免疫效果不佳、毒性强或保护时间短的缺点。
但传统疫苗研究存在以下限制：(1)部分病原微生物不能在体外或实验室条件下进行培养，如梅毒螺旋体和乙肝病毒等；(2)疫苗研发周期长，往往需要近10年的时间才能研制出一种安全的新产品；(3)不同血清型疫苗之间缺乏交叉保护性，无法抵抗异源病毒的侵袭；(4)不少疫苗存在免疫效果差、安全性不高及毒力变异等问题。
面对一些危害重大的疫病，如禽流感、疯牛病、SARS等，用传统的方法研究遇到了瓶颈，到目前为止尚无较大进展。禽流感病毒的多亚型性和高变异性使单一型疫苗无力应对，而SARS的突然流行也要求人们加快应对突发性的新病原的能力。目前，疫病的流行朝着突发性、高传播性、高致病性发展，这对传统的疫苗研究产生了极大冲击，我们迫切需要一种更加快捷、高效的疫苗研发途径。
2 反向疫苗学
随着细菌全基因组测序的展开及生物信息学的发展，以计算机全基因组扫描和蛋白质组学等为代表的新技术正在影响和改变疫苗研究。传统的由体外培养病原并用各种生物学技术分析研发疫苗的模式正向一种新型的、利用生物信息学等技术对病原微生物基因组序列进行分析，筛选具有保护性免疫反应的抗原作为候选疫苗的新方法发展。这种以基因组为基础的疫苗研发策略，因为和研制疫苗的传统方法截然相反而被人们称为反向疫苗学[1]。它采取大规模、高通量和计算机分析等方法，可以在短期内分别完成对不同细菌的大量候选抗原的克隆表达和提纯，不仅大大缩短了新疫苗的研制周期，也为过去不能用传统疫苗研究方法获得有效疫苗的疑难疫病的疫苗研发提供有效解决途径。同时基因组扫描的应用有助于预测和发现以往所不知的各种免疫原，为深入研究它们的特征及功能提供了可能。
相对于传统的疫苗研究方法，反向疫苗学存在几个明显的优势：(1)不需要培养微生物，整个过程从芯片法分析基因组序列开始，适用于所有微生物；(2)可以对一些危险的病原微生物进行操作；(3)病原在不同时期和环境表达的蛋白质抗原都会被分析用来作为候选抗原，即使在对微生物的致病机理和免疫应答了解不多的情况下也可运用。
3 反向疫苗学的研究方法及其在动物医学领域的应用
3．1 基因组筛选分析
在已获得的病原微生物基因组的基础上，利用数据库搜索编码毒力因子、分泌性蛋白或膜相关蛋白的序列[4]。从已知的基因组序列·设计PCR反应的引物，每对引物都含有合适限制性酶切位点以利于克隆到表达载体上。将每个PCR产物克隆并在外源系统中表达，利用His—Tag和GST融合表达技术使重组蛋白能被快速纯化。最后将纯化的重组蛋白免疫小鼠等动物，分析免疫血清，确定多肽的表面定位和它们的定性和定量免疫反应能力。
目前，基因组筛选分析已被用于多杀性巴氏杆菌的疫苗研究中。作为禽霍乱、牛肺疫、猪萎缩性鼻炎等动物疫病的病原，目前的多杀性巴氏杆菌疫苗只能提供对同血清型菌株的免疫保护，对异种血清型菌株的攻击缺乏保护。为了寻找具有交叉保护性的免疫原作为疫苗候选，Keith[5] 等人以多杀性巴氏杆菌基因组为基础，利用生物信息学工具分析和预测出129种候选蛋白，包括膜蛋白、分泌蛋白和脂蛋白，并利用大肠杆菌原核表达系统表达了其中的105种。将这些蛋白和免疫血清反应检测这些蛋白被免疫系统识别的情况，最终发现了6种新的具有免疫反应性的蛋白可作为疫苗候选。
3．2 基于蛋白质组学的反向疫苗研究
细菌的外膜蛋白最易与机体的免疫系统接触，因此能够诱导保护性免疫反应的蛋白质多是此类蛋白。但细胞膜是一个动态的环境，其成分常随着外界环境和细胞周期的改变而变化。单一的基因组的数据库分析无法预测这些动态的变化，而结合蛋白质组学的方法则可以分离鉴定菌体所有的蛋白，也可以研究比较不同环境下菌体分泌的蛋白质的差异，用于动态地研究各种蛋白质的功能[5]。进行蛋白质组分析时，首先要将样品分离，其中最常规的方法便是双向电泳技术。再利用蛋白质免疫印迹技术找出能与免疫血清中的抗体相结合的蛋白点，然后用质谱技术，如MALDI—TOFMS、ESI—MS等鉴定多肽序列，在数据库中搜寻相对应的氨基酸序列，鉴定所分离的蛋白质[6 ]，并搜寻编码该蛋白的基因序列，通过原核或真核表达大量获得这类蛋白来进行后续免疫实验。因为被检蛋白与抗体有良好的结合能力，能刺激机体的免疫系统，这类蛋白质将成为候选疫苗成分。
作为水体中广泛存在的一种致病菌，嗜水气单胞菌能够引起鱼类和其他动物的败血症等疾病，对鱼类养殖业造成了很大的威胁。目前控制该病的有效方法是使用抗生素或进行疫苗免疫。但抗生素残留及细菌耐药性的变化使抗生素的使用受到了限制，控制该病的重点便放在了疫苗免疫上。
Chen[7]等利用蛋白质组学的方法，提取了嗜水气单胞菌的外膜蛋白，并用双向电泳技术分离，再利用免疫血清进行免疫印迹，找到8种具有免疫反应性的蛋白点，结合质谱技术对这些蛋白点进行鉴定分析。最终通过免疫实验，发现其中3种外膜蛋白具有良好免疫原性和免疫保护效果。
3．3 病原毒力因子的检测
细菌的毒力因子(分泌蛋白、膜蛋白等)是现用疫苗的主要成分，因此，探索和发现毒力因子成为疫苗研究的关键。
毒力是病原菌侵入机体后，在许多基因产物的协同作用下使动物发病的能力，因而研究毒力因子的最有效方法是利用动物模型进行体内试验。近年来出现了一些筛选毒力因子的新方法，如STM[8] (特征标签突变)、IVE (体内表达技术)以及IVIAT-10]等，并都被成功地应用于细菌毒力因子的研究中。
特征标签突变(Signature tagged mutagenesis，STM)使用带有不同标签(序列各不相同的DNA短片段)的转座子插入细菌染色体中与毒力有关的基因后，该突变株在感染动物体内会消失，通过标签特异DNA 杂交从感染前的细菌群体中可检出该突变株，确定毒力基因。在对鼠伤寒沙门氏菌和金黄色葡萄球菌的毒力因子研究中，STM 技术的应用使更多新的与毒力相关基因被发现，对于深入了解病原菌的致病机理提供了基础。
体内表达技术(In vivo expression technology，IVET)是由Mahan等报道的检测毒力因子的方法。它能确定动物感染过程中被特异地诱导出来的基因或毒力因子。自1994年该技术首次应用于鼠伤寒沙门氏菌毒力因子的研究后，至今已在该菌中发现了100多个体内表达基因的信息。利用相同技术在胸膜肺炎放线杆菌中也发现了4个在体内特异表达的基因 。
IVIAT是一种鉴定微生物体内表达基因尤其是感染特异基因的新技术，它通过体外培养的病原微生物来吸附免疫血清从而扣除病人血清中针对病原菌体外表达抗原的抗体，再用此吸附过的血清作为探针来筛选该病原微生物的基因组表达文库，就可以获得病原微生物体内诱导表达基因。目前该技术的应用仅停留在人致病性病原，如结核茵、霍乱弧菌和大肠杆菌的体内诱导表达基因的研究中，取得了较大进展。
4 前景展望
目前为止，人们已经获得了许多病原微生物的全基因组序列，而且这一数目还在不断增加。技术的发展使基因组测序更加方便、快捷和准确，相信在不久的将来，大多数危害公共健康的微生物的基因组序列信息将被破解。结合反向疫苗学在多杀巴氏杆菌等病原研究中的成功应用，它必然会发展成为一种有效、快速的疫苗研制手段。高通量、自动化、大规模筛选可在短时间完成大量候选疫苗抗原的筛选工作，使疫苗研制周期大大缩短，并且可以同时研究多种病原，这为以后应对突发性疾病和新传染病的暴发提供了有力的支持。在面对一些应用传统方法尚未获得进展的病原时，反向疫苗学也显示出了强大的优越性。
反向疫苗学作为传统疫苗研究的补充和延伸，虽然还存在诸多的技术限制，如表达蛋白要有正确的构象才具有免疫原性，只能筛选蛋白抗原等，但这些难题终将被克服。更多新技术的应用也使得反向疫苗研究得到补充和完善，通过这些方法的应用发现了一系列与毒力、耐药和定居等相关的基因，并且可以在此基础上深入研究病原体与宿主的相互作用，从而为研制更加有效的疫苗奠定了基础。
参考文献
[1]Rappuoli R．．Reverse vaccinology[J]．Curr Opin micro，2000，31：445～ 450
[2]Marirlosa M．．Reverse vaccinology[J]．Resemse focus，2003，8(10)：459——464
[3]Grandi G ．Antibacterial vaccine design using genomics and pro-teomics[J]．Trends Biotechnol，2001，19：181～188
[4]A1一Hasani K．，Boyce J．，McCarl VP．，et a1．Identification of novel immunogens in Pasteurdla multocida[J．Micmb Celt Fact，2007，6：3
[5]Pandey A．，Mann M．．Proteomics to study genes and genomes[J]．Nature，2000，405：837～ 846
[6]Jungblut PR．，Schaible UE．，MoUenkopf}{J．，et a1．Comparative proteome analysis of mycobacterium taberculosis and Mycobacterium bovis 13(2G strains： towards functional genomies of microbial pathogens[J]．Mol Biol。1999，33：1103～1117
[7]Chen Z．，Peng B．，Wang S．，et a1．Rapid screening of highly efficient vaccine candidates by immunoproteomics[J]．Proteomics，2004，4(10)：3203～3213
[8]Hensel M．，Shea JE．，Gleesen C．，et a1．Simultaneous identification of bacterial virulence genes by negative selection[J]．Science，1995，269：400～403
[9]Mahan MJ．，Slauch JM．，Mekalanos JJ．．Selection of bacterial virulence genes that are specifically reduced in host tissues[J]．Science，1993。259：686～688
[10]Handfield M．，brady LJ．，Progulske—fox A．，et a1．IVIAT：a novel method to identify microbial genes expressed specifically during human infections[J]．Trends microbial，2000，8(7)：336～339
[11]Fullet PE．，Shea R．1．，Thacker BJ．，et a1．Identification of in vivo induced genes in Actinobacillus pleuropneumoniae[J]．Microb Pathog，1999，27(5)：311～327