摘要: 已有证据表明整合子是细菌发生水平基因转移和产生耐药机制的主要因素。目前知道的整合子可分为两类:多重抗性整合子和超级整合子。多重抗性整合子基因盒可编码一种或多种耐抗生素和消毒剂基因,存在于转座子、质粒和细菌染色体;超级整合子有的可以同时携带数百个基因盒,可以编码很多不同的功能基因,它们只在细菌的染色体上存在,目前只在特定菌株中发现超级整合子。研究表明,整合子上的基因盒可能最初都来之于超级整合子。本文就超级整合子的结构、分布、起源及它对基因进化产生的影响等几个方面的研究进展进行讨论。
关键词: 整合子; 整合酶; 基因盒; 超级整合子
整合子(integron)由Stokes等[1]于1989年首次提出;它是由整合酶的编码基因、耐药基因盒和耐药基因盒的整合位点所组成的遗传单位。这些遗传结构是组成开放阅读框(open reading frames,ORFs)的基因表达单位,并且将它们转换成功能性基因。已有证据表明整合子是细菌发生水平基因转移和产生耐药机制的主要途径[2]。目前已知的整合子可分为两类:多重抗性整合子(multiple resistance integron,MRI)和超级整合子(super integron,SI)。根据整合酶不同可分为一到九类整合子,其中一到三类整合子属于多重抗性整合子,其余的都属于超级整合子。
20世纪90年代末,Mazel等在霍乱弧菌基因组中首次发现超级整合子(SI)[3]。代写毕业论文和所有已知的整合子一样,SI也是由除了带有attC位点的外源基因盒外所必须的三个关键部分组成:①编码整合酶的基因(intI);②主要的结合位点(attI);③强启动子[4,5]。但是它远大于传统的整合子,能携带数百个基因盒,有类似59-be的结构,是一种新型整合子。之后在其它弧菌属细菌中也发现各种超级整合子。
随着研究的深入,人们发现超级整合子不但与以往的多重抗性整合子有很大的不同,而且它在整合子的起源进化方面有着重要的研究意义,成为研究热点。本文将就超级整合子的结构、分布、起源及它对基因进化产生的影响等几个方面的研究进展进行讨论。
1 SI的结构
SI已在多种细菌中发现,并在基因组进化过程中发挥作用。与MRI不同的是:①SI一般都在细菌的染色体上,是不能移动的,而RI通常位于一些可移动的DNA单位上;②SI上基因盒的结合位点(attC)是高度保守的,RI中基因盒在长度和序列上都是多变的。RI中与基因盒相连的59-be在霍乱弧菌SI中称为霍乱弧菌重复序列(Vibrio choleraerepeats,VCRs),它表现出很高的同源性。另外,霍乱弧菌SI基因盒还是I类整合酶的作用底物[3]。
霍乱弧菌SI(也称之为第四类整合子)存在于两条染色体中较小的染色体上,长度为126kb,包含至少179个基因盒,占整个染色体基因组的3%[6],基本结构见Fig.1。
1.1VCRs
研究发现霍乱弧菌基因组包含有重复序列VCRs,这种结构相似于整合子中的59-be元件。VCRs是由121~126个不完全对称的碱基对长度序列的家族;他们都以反向核心序列(inverse core site,ICS)序列开始,以和整合子基因盒一致的GTTARRY(R代表嘌呤,Y代表嘧啶)的核心序列(core site,CS)结束;ICS也总是与上游的VCR的CS互补;VCRs一般被不多于2个的开放阅读框(ORFs)分隔开,并且大多数基因盒中一般都只有1个ORF。attC位点结构的5′端是反向核心序列RYYTAAC,3′端即为核心序列GTTARRY(结合作用发生在G和第一个T之间[7]),ICS总是与位于基因上游的CS严格互补的,核心序列中间为可变区。
最初确定VCRs存在于热稳定毒素基因周围[8]。它们可形成一个高度保守序列家族[9]。不过当分析霍乱弧菌SI的25个独立的基因盒上的VCRs序列时,发现它们只有41%的同源性,当除去2个较多变的VCR序列后,剩下的23个序列的同源性可达到74%[6],提示一些基因盒已经通过水平转移从另外的细菌物种中的超级整合子获得这个序列。
如前所述,VCR基因结构已被证明是第一类整合酶的作用底物,即第一类整合酶能介导超级整合子基因盒的插入或切除,表明超整合子可能是多重耐药整合子及其基因盒的祖先。
1.2 基因盒
研究表明,SI对某一物种是特异的。在霍乱弧菌中,被整合子捕获的基因资源相当丰富。它们的序列对宿主菌的生长是非必要的,但能在正常的条件下遗传下来,说明这些开放阅读框可能编码一些适应性的功能蛋白,并且可以为功能基因组的研究提供各种各样的基因,其中包括热稳定毒素(heat stable enterotox-in,sto)、甘露糖-岩藻糖抗性的血凝素(mannose-fucose-resistant hemagglutinin,mrhA)和弧菌脂蛋白A(Vibriolipoprotein A,VlpA)(一种外膜蛋白,首次发现存在于细菌中)等[10];暂时还没有发现在SI中有已知的编码耐抗生素的基因,但在多重抗性整合子中发现的blaP4和dfrVI基因盒(编码耐β-内酰胺类抗生素的酶和耐甲氧苄氨嘧啶的二氢叶酸还原酶)的59-be元件与霍乱弧菌SI中的VCRs序列很相似[11];另外,一些潜在的可编码类似于耐氨基糖苷、天然氨基酸类似物PPT、链丝菌素、氯霉素的基因盒在SI中还是存在的[12](Tab.1)。
1.3 整合酶
编码整合酶的基因intI位于整合子的5′保守端,属于酪氨酸整合酶家族,负责催化基因盒在attI和attC上的整合及切除。它包括典型的酪氨酸整合酶的保守的结构域,另外还有一个独有的结构域,该结构域不存在于其他类型的酪氨酸整合酶,故可以用来区别不同类型整合子中的整合酶[13]。霍乱弧菌超级整合子的整合酶基因根据序列的不同和发现的先后顺序被命名为intI4[3],缩写为VchintIA。VchintIA位于第一个基因盒上游225bp的位置,可编码320个氨基酸,与第一类整合酶有45.5%的同源性,转录方向和大多数基因盒转录方向相反[14]。第一个结合位点处于VchintIA下游第一个基因,VchintIA上游是没有插入序列的。
在超级整合子的最后一个基因盒核心区GTT下游352bp有一个插入序列,这个插入序列后面的基因是一个和代谢有关的基因,它和已知的59-be没有多大关系。intI4末端104bp处下游是编码核糖体L20蛋白的rplT。由于这两部分的结构没有任何的相似性,排除了该超级整合子是一个未知的转座子的可能性[6]。
在MRI中,坐落在attI位点上游的一个强启动子指导着基因盒的转录。这样的启动子可能也存在于attI4位点上游,但它不能够确保其末端基因盒的表达[6]。我们可以估计,一些基因盒能携带自己的启动子并能通过转录使位于其下游的基因盒表达,这样的“启动子”基因盒可能就是为了这个目的而被选择带有这样的功能。
2 SI的分布
SI使细菌获得外源基因,快速适应不可预测的外界环境的变化,也改变了遗传成分和宿主菌的进化。在某些弧菌如假单胞菌、黄单胞菌、沙雷菌和亚硝化单胞菌等超过20个菌种中都发现有SI[3,12,15~17]。大多数细菌种类属于不同的γ、β或δ多变细菌属,有的由于其特殊的能力对人类的生活等将产生巨大的影响,对它们的研究有重要意义。SI对这些细菌结构进化的影响是多种多样的,我们可以据此了解SI的祖先,具体的分布情况见Tab.2。
3 SI的起源及其对进化的影响
SI和MRI相比:①它的每个开放阅读框都与一段保守的重复序列(VCRs等)相连;②一些ORFs还有自己的启动子;③还有一些能够反向编码。虽然SI可能有很多不用的起源,但是根据基因盒中ORFs的GC%和密码子使用情况的不同,显示了它们和一些高度保守的序列相关,这种特征说明在弧菌中VCRs是另外加到ORFs上的。据此,Hall[18]提出了一个反转录机制模型以解释基因盒形成的起源。VCR作为反转录引物,通过限制酶的作用底物,能够限制一个外源基因的表达。但是,一些弧菌基因盒有它自己的启动子或者相对于VCR有着相反的转录方向,与VCR引物/反转录模型有着不一样的特性。以上都说明这种捕获过程可能是内源的。拟态弧菌中的整合酶intI5与intI1有94%的核甘酸同源性;而梅氏弧菌关系较远,它的整合酶与intI4有76%同源性,重复序列相似而分散[6]。腐败希瓦菌intI蛋白与霍乱弧菌的intI4有44%的同源性,它与MRI的intI2有59%的同源性(Fig.2)。产碱假单胞菌重复序列(Pseudomonas alca-ligenesrepeats,PARs),其序列间有大于90%的同源性,与VCR和VMR相比在ICS和CS序列间却保留很少的片段。
对细菌种系发生史(phylogenesis)的研究表明,超整合子整合酶基因intI的变异程度与细菌种间差异程度一致,这种差异与细菌为适应环境而捕获多种来源的基因-XXRs结构有关。intI与XXRs共同进化,细菌亲缘性愈高,其intI与XXRs的相似性愈大。由于超整合子的任何ORF都有可能被构建成基因盒,因而整合子对细菌的进化起着重大作用[19]。
SI一个显著特征就是它内源基因盒的重复序列是高度保守的。如果SI的attC基因和那些缺乏同源因,并插入转座子等高度移动性结构以增强细菌对环境的适应能力,使SI逐渐进化形成了MRI。MRI的attI位点像转座子一样高度不稳定,这种不稳定性和抗生素使用所带来的选择压力使它们不得不从多种SI去捕获特异的抗性基因。细菌通过水平捕获外源基因的方法迅速适应变化莫测的周围环境。超级整合子的结构无疑为细菌基因的水平转移提供了有利的途径。
参考文献
[1] Stokes H W, Hall R M. A novel family of potentially mo-bile DNA elements encoding site-specific gene-integration functions: integrons [J].Mol Microbiol,1989,3(12):1669
[2] Rowe-Magnus D A, Guerout A M, Mazel D. Bacterial resistance evolution by recruitment of super-integron gene cassettes [J].Mol Microbiol,2002,43(6):1657
[3] Mazel D, Dychinco B, Webb V A,et al. A distinctive class of integron in theVibrio choleraegenome [J].Sci-ence,1998,280(5363):605
[4] Hall R M, Stokes H W. Integrons: novel DNA elements which capture genes by site-specific recombination [J].Genetica,1993,90(2~3):115
[5] Levesque C, Brassard S, Lapointe J,et al. Diversity and relative strength of tandem promoters for the antibiotic-resistance genes of several integrons [J].Gene,1994,142(1):49
[6] Rowe-Magnus D A, Guerout A M, Mazel D. Super-inte-grons [J].Res Microbiol,1999,150(9~10):641
[7] Stokes H W, O′Gorman D B, Recchia G D,et al. Struc-ture and function of 59-base element recombination sites associated with mobile gene cassettes [J].J Mol Biol,1997,26(4):731
[8] Ogawa A, Takeda T. The gene encoding the heat-stable enterotoxin ofVibrio choleraeis flanked by 123-base pair direct repeats [J].Microbiol Immunol,1993,37(8):607
[9] Clark C A, Purins L, Kaewrakon P,et al. VCR repetitive elements in theVibrio choleraechromosome constitute a maga-integron [J].Mol Microbiol,1997,26(5):1137
[10] Barker A, Manning P A. VIp A ofVibrio choleraeO :1 :the first bacterial member of the alpha 2 micro-globulinlipocalin superfamily [J].Microbiogy,1997,143(6):1805
[11] Rowe-Magnus D A, Mazel D. Resistance gene capture[J].Microbiol,1999,2(5):483
[12] Rowe-Magnus D A, Guerout A M, Ploncard P,et al.The evolutionary history of chromosomal super-integrons provides an ancestry for multiresistant integrons [J].
Proc Natl Acad Sci USA,2001,98(2):652
[13] Messier N, Roy P H. Integron integrases possess a unique additional domain necessary for activity [J].JBacteriol,2001,183(22):6699
[14] Collis C M, Kim M J, Partridge S R,et al. Characteriza-tion of the class 3 integron and site-specific recombination system it determines [J].J Bacteriol,2002,184(11):301
[15] Heidelberg J F, Eisen J A, Nelson W C,et al. DNA sequence of both chromosomes of the cholera pathogen Vibrio cholerae[J].Nature,2000,406(6795):477
[16] Clark C A, Purins L, Kaewrakon P,et al. TheVibrio choleraeO1 chromosomal integron [J].Microbiogy,2000,146:2605
[17] Nield B S, Holmes A J, Gillings M R,et al. Recovery of new integron classes from environmental DNA [J].FEMS Microbiol Lett,2001,195(1):59
[18] Hall R M. Mobile gene cassettes and integrons: moving antibiotic resistance genes in gram-negative bacteria [J].Ciba Foundation Symposium,1997,207:192
[19]李咏梅,王冰梅,陈曦.基因盒-整合子系统与细菌耐药性[J].北华大学学报,2003,4(5):400